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西方墨點法 (Western Blot)
西方墨點法 (Western Blot)
利用抗體對特定蛋白質的專一性結合以及蛋白的位置訊息來分析蛋白質在細胞或組織的表現狀況。
步驟方法
‧樣品處理
通常分為機械式以及試劑式兩種樣品處理方式將蛋白從細胞或組織釋放出來，一般而言，試劑的方式對蛋白而言是比較溫和的做法，處理步驟也比較快速，Pierce 有針對不同細胞推出對應的蛋白粹取試劑，品質效果會較好。
‧膠體電泳 (Gel
electrophoresis)
利用等電點 (pI)，分子量，電荷等因素的組合，將蛋白質依據電荷大小分離開來，分子量大的蛋白會移動較慢，分子量小的蛋白會移動較快。
 ‧轉漬 (Transfer)
為了使蛋白質能讓抗體進行專一性的結合，需使用電流將蛋白由凝膠轉移到 PVDF 或 nitrocellulose 材質的膜上。
 ‧阻攔 (Blocking) 由於抗體以及目標蛋白都屬於蛋白質，因此都會殘留再轉漬膜上(如上圖) ，因此需要利用別的蛋白將膜上孔洞填滿(如下圖)，避免沒有結合目標蛋白的抗體殘留再轉漬膜上，一般使用 3-5% 的 BSA 蛋白，如要品質穩定可以參考 Pierce 推出的 blocking buffer。 ‧檢測 (Detection)
利用接有能和探測劑反應物質的抗體(例如接有 HRP 的抗體)，針對目標蛋白進行專一性結合。
 ‧分析 (Visualization)
利用探測劑檢測專一性結合在目標蛋白上的抗體，現在大多使用受質化學發光 ECL (Chemiluminescent
detection) 的偵測方式，其原理是當受質(substrate)和帶有 HRP 的抗體結合後會發光的原理，接著在影像系統中即可偵測到目標蛋白的條帶訊號。
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