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西方墨點法 (Western Blot)

張貼者:2015年9月8日 下午8:24艾克索生物科技產品部   [ 艾克索 已於 2016年5月18日 上午12:06 更新 ]

西方墨點法 (Western Blot)

利用抗體對特定蛋白質的專一性結合以及蛋白的位置訊息來分析蛋白質在細胞或組織的表現狀況。



步驟方法

樣品處理

通常分為機械式以及試劑式兩種樣品處理方式將蛋白從細胞或組織釋放出來,一般而言,試劑的方式對蛋白而言是比較溫和的做法,處理步驟也比較快速,Pierce 有針對不同細胞推出對應的蛋白粹取試劑,品質效果會較好。


膠體電泳 (Gel electrophoresis)

利用等電點 (pI)分子量,電荷等因素的組合將蛋白質依據電荷大小分離開來,分子量大的蛋白會移動較慢,分子量小的蛋白會移動較快。



轉漬 (Transfer)

為了使蛋白質能讓抗體進行專一性的結合,需使用電流將蛋白由凝膠轉移到 PVDF 或 nitrocellulose 材質的膜上。


阻攔 (Blocking)

由於抗體以及目標蛋白都屬於蛋白質,因此都會殘留再轉漬膜上(如上圖) ,因此需要利用別的蛋白將膜上孔洞填滿(如下圖),避免沒有結合目標蛋白的抗體殘留再轉漬膜上,一般使用 3-5% 的 BSA 蛋白,如要品質穩定可以參考 Pierce 推出的 blocking buffer


檢測 (Detection)

利用接有能和探測劑反應物質的抗體(例如接有 HRP 的抗體),針對目標蛋白進行專一性結合。



分析 (Visualization)

利用探測劑檢測專一性結合在目標蛋白上的抗體,現在大多使用受質化學發光 ECL (Chemiluminescent detection) 的偵測方式,其原理是當受質(substrate)和帶有 HRP 的抗體結合後會發光的原理,接著在影像系統中即可偵測到目標蛋白的條帶訊號。





相關產品資訊





Western Blot 專刊

張貼者:2015年8月28日 上午12:02艾克索生物科技產品部   [ 艾克索 已於 2016年5月18日 上午12:07 更新 ]


免疫組織化學染色法 (immunohistochemistry; IHC)

張貼者:2015年8月27日 下午8:25艾克索生物科技產品部   [ 艾克索 已於 2016年5月18日 上午12:07 更新 ]

免疫組織化學染色法 (immunohistochemistry; IHC)

免疫組織化學染色法(immunohistochemistry; IHC)正如其名稱所示,是結合了三個不同領域的專業免疫學(immunology)、組織學(histology)與化學(chemistry)所發展出來的一項技術。它能在組織切片、細胞抹片或培養檢體上,運用免疫反應(immune response)中抗原(antigen; Ag)和抗體(antibody; Ab)間的專一結合性,並在抗體上呈現可供偵測的訊號(reporter),以便觀察檢體中是否有目標抗原的存在。歷經數十年的改進後,免疫組織化學染色法已是今日臨床醫學生物研究上,相當常用的重要工具,它不但具有很好的特異性(specificity)靈敏度(sensitivity)也更為簡便快速和成本低廉。

免疫組織化學染色法的基礎是建立在抗原和抗體的專一性結合,因此,「抗體」顯然扮演極重要的角色。免疫組化所用的抗體可分為多株(polyclonal)和單株(monoclonal)兩類型。早期使用的均屬多株抗體,其製造是將純化後的抗原,注射至動物體中引發免疫反應,然後再從動物血中,獲取含所需抗體的免疫血清。它們是由多個B淋巴細胞株,所產生的抗體混合物,這類抗體會與抗原上的多種抗原位(epitope)結合,因此,特異性(specificity)較差,也較易引起交叉反應(cross reaction)。單株抗體則是從已被免疫的動物體中,篩選一個符合需求的B淋巴細胞,再運用細胞融合雜交瘤(hybridoma)技術備製所要的抗體。這類抗體僅辨識抗原的某單一抗原位,所以用它進行免疫組化實驗時,其特異性強,敏感性也高。

圖:單株抗體在辨識目標抗原位的專一性遠優於多株抗體



應用

IHC用於疾病診斷,藥物開發和生物學研究。使用特定的腫瘤標誌物,醫生使用IHC來診斷癌症為良性或惡性的,確定腫瘤的分期和分級,並確定一個轉移的細胞類型和來源找到原發腫瘤的位點。IHC 也用在藥物開發通過檢測任一的活性或上或下調控的疾病標靶,以測試藥物的療效。

免疫組織化學染色法(immunohistochemistry; IHC)在目前臨床研究與生物研究上,扮演一個相當重要的工具。





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